知識天地

以酸化PDA降低乳酸菌於PDA中被檢出的偽陽性

2019.04.23

摘要 

檢驗或活化黴菌及酵母菌常使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato dextrose agar, PDA),因為PDA含有 豐富碳素源及氮素源,一些乳酸菌亦可於此培養基上生長,用於檢測含活性乳酸菌食品時易導致偽陽性的 產生而誤判檢測結果。本研究以酸液調整PDA之pH值使乳酸菌在酸化PDA中不生長,而維持黴菌及酵母 菌之生長活性。研究結果顯示在pH 2.5~3.5環境下,乳酸菌在PDA無法生長,但黴菌及酵母菌不受低pH 環境影響,因此吾等認為利用酸化PDA檢測乳酸菌食品中的黴菌及酵母菌將更為準確。

關鍵字:食品微生物檢驗、乳酸菌、黴菌及酵母菌、酸化PDA
前言
臺灣保健食品市場規模隨著我國健康意 識提升而成長,2017年通過審查的保健食品 前五大功效訴求為調節血脂、胃腸功能改善、 免疫調節、護肝、骨質保健[1]。根據國內外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成 等功效,食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國人生活水平上升,對於食品衛生要求 愈發嚴格。檢測方法進行含乳酸活菌產品時, 若是以PDA為檢測培養基,檢測結果容易因 乳酸活菌生長於PDA中而有偽陽性。目前市 面上已有多種乳酸活菌產品,然而檢驗乳酸 活菌產品中黴菌及酵母菌時,因乳酸活菌能 生長於PDA上,導致不易判斷產品是否被黴 菌或酵母菌所污染。文獻指出酸可抑制乳酸
菌生長[2],而黴菌及酵母菌耐酸性較佳[3], 因此本研究欲以酸液調整PDA之 pH值,在 不影響黴菌及酵母菌生長的前提下,使乳酸 活菌不生長於PDA上。
材料與方法
培養基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth(馬 鈴薯葡萄糖培養基;PDB)、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth(乳酸桿菌 MRS 培 養基)、BD DifcoTM Agar(洋菜)皆購買自 啟新生物科技有限公司,新北市。鹽酸(HCl) 購自Sigma-Aldrich(德國)、85%磷酸(H3PO3) 購自第一化工原料股份有限公司(臺灣)、 檸檬酸(Cirtric acid)購自三?;す煞萦邢?公司(中國)、蘋果酸(Malic acid)購自國華 貿易股份有限公司(日本)。
10%(w/w)酸液製備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、 蘋果酸粉末分別加入無菌水中混勻至濃度為
10%(w/w),以0.22 m filter 過濾至無菌離 心管內備用。
實驗菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購自財團法人食品 工業發展研究所生資中心(新竹,臺灣)。
菌株活化 乳酸菌菌液製備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無菌接種環沾取至Lactobacilli MRS平板 進行四區劃線,倒置37℃於厭氧環境培養 48±2小時,培養完畢再將單一菌落以無菌接 種環沾取至Lactobacilli MRS Broth中,37℃ 於厭氧環境培養16~18小時。 真菌菌液製備 : 將黴菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無菌接種環進行四區劃線接種 至PDA平板,正放25℃培養5-7天,活化後 真菌平板以無菌接種環取單一菌落接種至 PDB,培養於25℃培養5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基(酸化 PDA) 製備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar,以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘,冷卻至45-50℃, 加入先前製備好之酸液由pH 5.1調整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配製方法經預實驗結果如表 1,不同酸液調整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配製酸化PDA調整至不同pH值 使用酸量如表2。

乳酸菌數檢測 利用傾注平板法進行乳酸菌數計數,操 作方法如下:取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進行序列稀釋,稀釋至10-6、 10-7,各稀釋液分別取1mL 至無菌培養皿, 再倒入15~20 mL經滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar,執行平板兩重覆, 待平板冷卻凝固後倒置培養於37℃厭氧環境 48 ± 2小時,培養後計數平板上的單一菌落, 菌落計數範圍介於25~250 CFU 之間,兩平 板菌落數平均後得實驗結果。
黴菌與酵母菌檢測 利用傾注法進行真菌活性檢測,操作方 法如下:將活化好之真菌菌液,經培養後以 傾注平板法培養於PDA 於 25℃培養5-7天, 觀察生長活性狀況。
乳酸菌於PDA上生長活性測試 同上述乳酸菌檢測方式,將乳酸菌以傾 注平板法檢測,培養條件比照黴菌與酵母菌, 培養基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar, 倒置培養於25℃培養5-7天,培養後計數平 板上的單一菌落,菌落計數範圍介於25~250 CFU之間,兩平板菌落數平均後得實驗結果。
酸性PDA對於乳酸菌與真菌生長活性測試 乳酸菌實驗方法同上述乳酸菌於PDA上 生長活性測試,使用培養基為酸化PDA,倒 置培養於25℃培養5-7天,培養後計數平板 上的單一菌落,菌落計數範圍介於25~250 CFU之間,兩平板菌落數平均後得實驗結果。 黴菌與酵母菌實驗方法同上述黴菌與酵 母菌檢測,將黴菌、酵母菌以傾注法於各酸 化PDA,正放於25℃培養5-7天,經培養後 觀察菌落型態生長活性狀況。
結果
為評估乳酸菌於PDA之生長狀況,本研 究將乳酸菌活化後經序列稀釋至適當稀釋倍 數後以傾注培養於MRSA及PDA,結果如表 3 所示,乳酸菌以傾注平板法接種於 MRS agar 及 PDA,乳酸菌於兩種培養基皆可生 長,並且其菌落數目無明顯差異。乳酸菌於 MRSA培養基上生長活性較佳,菌落呈白色 明顯肉眼可見,但由於PDA是黴菌與酵母菌 通用培養基,乳酸活菌雖然可以生長於此培 養基上,但對於部分乳酸菌較為不適,而生 長出的乳酸菌菌落形態會偏細小,較不易計 數。 藉由不同酸液調整至 pH 3.8之 PDA 確 認乳酸菌於一般酸化PDA生長活性。由表4 結果顯示部分乳酸菌由調整至pH 3.8 PDA傾 注培養幾乎沒有活性,但是 Lactobacillus plantarum 較為耐酸,活性較強,於 pH 3.8 之 PDA中菌數與MRS agar中菌數無明顯差 異。 以不同酸液調整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長(表4)。以此結果可 推斷以調整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長活 性,以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分 乳酸菌活性,但還是有耐酸特性較強的乳酸 菌無法被抑制,故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現乳酸活菌產品之衛生檢測結果。
根據表4 結果顯示,由各種酸液調整pH 之PDA對於L. plantarum生長活性無顯著差 異,為了改進此缺點,後續實驗使用實驗室 內最常見之酸液(鹽酸)製備酸化PDA,再 由上述實驗結果改良實驗方法,以10% 鹽酸 酸液調整 PDA 之 pH,由原始 pH5.1調整至 pH 3.5、3.0、2.5。各乳酸菌接種至 MRS Broth 37℃培養16~18小時,再以MRS agar 傾注培養37℃2-3天,同時以不同pH之PDA 傾注培養25℃5-7天,培養後觀察結果如表 5。將活性乳酸菌傾注培養於 pH 3.5、3.0、 2.5之 PDA 中,各乳酸菌皆無法生長,證明 降低pH值可以抑制乳酸菌活性。 為了確認真菌生長活性不受高酸性環境 影響,本研究將黴菌與酵母菌以傾注法培養 於不同 pH 之 PDA 平板,再以25℃培養5-7 天,觀察其生長情形,結果如圖1、圖2 所 示,代表黴菌的Aspergillus oryzae與代表酵 母菌的 Saccharomyces cerevisiae 皆可於低 pH之PDA平板生長,由此可知低pH 之PDA 黴菌與酵母菌亦可生長,觀察酸化PDA平板 生長之菌落型態與未調整pH之 PDA並無差 異,生長活性亦無明顯差別,將PDA酸化可 大幅降低乳酸菌在PDA中檢出機率,且不影 響黴菌與酵母菌檢測,進而降低檢測報告之 偽陽性。


討論
依據本研究結果乳酸菌於PDA上生長活 性測試結果證明乳酸活菌可被PDA檢出來。 若以無經處理之PDA檢測含活性乳酸菌之產 品,檢測結果可能會有偽陽性,進而影響品 管檢驗判定。為使品管檢驗更加準確,必須 開發抑制乳酸菌於PDA之生長活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實可抑制乳 酸菌生長活性,但有部分乳酸菌耐酸度較強, pH 3.8亦可生長。由此可知酸化是一個有效 且可行的方法,但需再作改善,經由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實能有效抑制乳酸菌 活性,且不影響黴菌與酵母菌生長活性,因 此,將PDA酸化至pH 3.5-2.5範圍內後再檢 驗含乳酸活菌產品,可以使衛生檢驗結果降
低其偽陽性而更加準確。本研究使用一株酵 母及一株黴菌做為測試基準,未來將進一步 測試多種真菌於酸化PDA生長情形,以確認 酸化PDA檢驗適用性。
參考文獻
1. 食品工業發展研究所。2018 食品產業年鑑。 2018.08.08。食品工業發展研究所。臺灣。 2. 林志勳。有機酸和乳酸菌之相互關係?,F代養豬。 2011; 32:18-20。臺灣動物科技研究所, 臺灣。 3. 王鳳梅,馬利兵。內蒙古西部地區本土葡萄酒釀酒 酵母發酵特性研究。2015; 31:204-8,生物技術通報。 中國。 4. 衛生福利部食品藥物管理署。食品微生物之檢驗方 法-黴菌及酵母菌數之檢驗。2013。2013.09.06部授 食字第 1021950329 號公告修正。行政院衛生福利 部,臺灣。

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